一 对于一个 realtime qPCR 而言，首先就是实验材料的处理和料然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%进行实验和数据分析这一部分单独说明实验材料的处理和准备 在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解尤其对于绝对定量的样品引物设计 一般realtime PCR 引物的。

U6是一类核小分子RNA，由RNA聚合酶III启动做miRNARTPCR有茎环法和加尾法，U6很常用，你自己查相关的文献就能看到别人现成设计好的加尾法的反向引物的通用的，正向引物就拿U6的序列，自己设计就行序列在下面Tomato U6 small nuclear RNA gene 1 ataaatcttt ttaatttata gtatatttat gtaagttttc。

不同应用场景的引物设计普通PCR使用设计工具如Primer3Geneious等，保证产物大小适中表达载体引物如构建PCMVTAG2Bgata4载体，需确保起始密码子位置正确，避免移码突变qPCR引物跨内含子设计，避免基因组污染，推荐使用Ensembl数据库以上实用策略来自益加医的每日10分钟，精通引物设计课程，现在。

4 Realtime qPCR和常规PCR的区别实时检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量三Realtime qPCR实验设计 1 实验材料的处理和准备对照组CON和处理组TRT，组内要有生物重复2 引物设计扩增产物长度在80150bp引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性产物不能形成。

数字PCRdPCR是绝对定量，基于泊松分布，直接测定靶序列的原始浓度，具有极高精确性逆转录PCRRTPCR针对RNA分子，先逆转录成cDNA，再进行DNA扩增RTqPCR结合了RTPCR和qPCR，可同时实现RNA的逆转录和定量分析PCR反应体系包括模板DNA引物底物DNA聚合酶和PCR缓冲液等基本成分每种PCR。

基因表达检测QPCR详解QPCR技术基于荧光监测每轮PCR反应后产物总量的实时检测，用于追踪PCR扩增过程主要检测方法有加尾法和颈环法，其中加尾法适用于miRNA的定量检测，通过RNA加尾和引物延伸，仅需少量样本1μg且无需分离miRNA，一次反转录产物可适用于多种miRNA检测，具有高通量和准确性颈环法则。