1、3构建dCas9target稳转株 稳转株蛋白构建完成后，用flag抗体或目的蛋白抗体检测稳转株是否构建成功，如果载体上有荧光蛋白，可用荧光检测细胞株是否构建成功4FlagChIPQPCR验证sgRNA的工作效率 1怎样避免sgRNA脱靶？脱靶效应与sgRNA的精确设计有着密切的关系，一般的sgRNA设计网站都会给出设计序列相应的。

2、通过加入同源序列，构建好质粒就可以啦 具体可以参见张CRISPRCas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling里面有详细的说明，不懂可以看文章的补充材料。

3、几年前，他们使用基因编辑工具 CRISPRCas9成功的剔除来自爱滋病患的细胞然而，只有细胞实验的数据尚不足以发展一种新的疗法，因此这次他们尝试使用活体动物来进行试验他们使用大鼠rats及小鼠mouse两种模式动物进行试验，首先，研究团队设计了一段HIV的基因，透过分子技术，让老鼠体内几乎所有细胞都被。

4、敲除在外显子上设计gRNA引导cas9切割，造成双链断裂，当缺失的碱基数为3的倍数，修复后可发生移码突变 敲入gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以外源携带敲入片段的DONOR作为模板进行同源重组修复HDR，将敲入片段重组到基因组靶点点突变gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后。

5、目前，三代目标区域测序技术已被应用于疾病或癌症领域HLASTR融合基因甲基化检测等研究中目标区域富集的方法主要有三类长片段PCR扩增CRISPRCas9靶向捕获和液相探针捕获下面为大家进行一一介绍长片段PCR扩增因其引物设计成本低，实验流程规范，是基因组靶向富集常用的方法之一但PCR过程中容易。

6、扩展知识功能特点CRISPR是生物科学领域的游戏规则改变者，这种突破性的技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现切除并取代DNA的特定部分这种技术的影响极其深远，从改变老鼠皮毛的颜色到设计不传播疟疾的蚊子和抗虫害作物，再到修正镰状细胞性贫血等各类遗传疾病等等该技术具有非常精准廉价易于。

7、上面的答非所问，我来解释一下吧基因编辑想要实现定点编辑，必须设计一段20bp左右的引物连接guide RNA来引导Cas9对基因进行切割，这段引物很关键，通常是你想编辑的目标基因序列的某个特殊位置crisprcas9系统进入体内后，引物会特异识别要编辑的基因及其序列位置，引导Cas9对其识别位点PAM序列前几。

8、记住primer50设计出来的100%好的引物，到了定量PCR上不一定好使，这是我最大的经验定量pCR的引物对匹配度要求不高，我现在使用的引物就有几个碱基不匹配，但实验结果很好有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎，直接到罗氏网站上专区上找引物罗氏网站在线有一个引物设计软件。