1、CRISPRCas9三sgRNA设计好之后 对前期文章的补充 设计sgRNA之后，需要对结果进行判断提交订单，等待引物到达 华大基因的速度非常快，大约在23个工作日即可拿到，在等待期间需要准备好感谢师兄DZ。

2、不要合成pam序列，只要保证待结合的片段 在N20结合区域 后面 紧跟着pam序列即可。

3、sgRNA在CRISPRCas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用因此，设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。

4、6 筛选细胞单克隆测序 实验步骤1设计sgRNA 针对小鼠LIF基因座Musmusculus，NM_008501设计了三种sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点2构建sgRNACas9载体 然后将选择的sgRNA设计克隆到pLentiU6。

5、设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到14重做该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作22合成sgRNA。

6、设计sgrna时正义链和反义链的区别如下DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链有意义链或正链+链另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链与mRNA核苷酸序列相同的那条链U。